Модифицированная люцифераза светится в 5 раз ярче

Источник: molbiol.ru

Для наблюдения за клетками ученые используют специальные ферменты, объединенные общим названием люцифераза. Эти протеины обладают биолюминсцентными свойствами и подсвечивают исследуемые клетки. Ученым из Института биофизики СО РАН удалось создать модифицированный вариант белка, свечение которого в 5 раз ярче, чем у природных аналогов. Как пояснил руководитель исследования Евгений Высоцкий, заведующий лабораторией фотобиологии, за основу был взят протеин, вырабатываемый ракообразными вида Metridia longa. Он имеет ряд преимуществ по сравнению с другими типами люциферазы. К примеру, фермент, вырабатываемый светлячками, вступает в биолюминсцентную реакцию только при наличии специального субстрата люциферина, ионов магния, АТФ и доступе кислорода.

Люциферазе ракообразных для свечения необходим только кислород и субстрат — целентеразин. Еще один плюс — данный протеин после синтеза выводится из клетки наружу (секретируемый тип ферментов). Это свойство дает возможность отслеживать внутриклеточные события, не разрушая клетки и ткани. Наконец, у ученых уже был опыт работы с геном Metridia longa, кодирующим люциферазу. В ходе нового исследования ученые клонировали этот ген и видоизменили его таким образом, что в итоге стал получаться новый, более эффективный тип фермента. Ученым удалось «обрезать» N-концевую часть белка, не вовлеченную в процесс биолюминсцентной активности. То есть из молекулы был удален «лишний», не влияющий на реализацию основной функции участок.

Модифицированный ген, кодирующий мутантную форму белка, был внедрен в плазмиды (тип молекул ДНК, закрученный в сверхспираль и замкнутый в кольцо). Плазмиды, способные к самовоспроизведению в клетке-хозяине, были помещены в клетки бактерий E. coli. После такой процедуры клетки кишечной палочки обрели способность к синтезу мутантной люциферазы. Ученые выделили полученный белок и тщательно его исследовали. Выяснилось, что интенсивность свечения и эффективность реакции значительно возросли. Авторы проекта отмечают, что люцифераза Metridia longa с удаленной нефункциональной частью является эффективным инструментом для люминисцентного анализа клеток млекопитающих. Чувствительность мониторинга в этом случае намного выше, чем при использовании природных протеинов.